Knock-in

Das Knock-in (auch Gen-Knock-in, engl. für ‚hineinklopfen‘) bezeichnet in der Genetik Verfahren zur gezielten Insertion eines Transgens, d. h. eines zuvor in einem Genom nicht vorhandenen Gens<ref>Greg Gibson: A Primer Of Genome Science., 2. Auflage, Sunderland, 2004. ISBN 0-87893-232-1. S. 308.</ref> oder von neuen oder veränderten DNA-Sequenzen.

Prinzip

Die Insertion des Transgens erfolgt meistens in einen spezifischen Genlocus des Genoms von Zelllinien oder Modellorganismen wie Mäusen.<ref>J. F. Mata, T. Lopes, R. Gardner, L. E. Jansen: A rapid FACS-based strategy to isolate human gene knockin and knockout clones. In: PloS one. Band 7, Nummer 2, 2012, S. e32646, ISSN 1932-6203. doi:10.1371/journal.pone.0032646. PMID 22393430. PMC 3290580 (freier Volltext).</ref><ref>J. Dunkelberger, L. Zhou, T. Miwa, W. C. Song: C5aR expression in a novel GFP reporter gene knockin mouse: implications for the mechanism of action of C5aR signaling in T cell immunity. In: Journal of Immunology. Band 188, Nummer 8, April 2012, S. 4032–4042, ISSN 1550-6606. doi:10.4049/jimmunol.1103141. PMID 22430734. PMC 3324670 (freier Volltext). </ref> Im Gegensatz zur klassischen Erzeugung gentechnisch veränderter Organismen erfolgt die Insertion sequenzspezifisch,<ref>B. C. Cox, Z. Liu, M. M. Lagarde, J. Zuo: Conditional gene expression in the mouse inner ear using Cre-loxP. In: Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. Band 13, Nummer 3, Juni 2012, S. 295–322, ISSN 1438-7573. doi:10.1007/s10162-012-0324-5. PMID 22526732. PMC 3346893 (freier Volltext).</ref> wodurch weniger Störungen der Genexpression durch Insertion in transkriptionsaktiven Bereichen der DNS entstehen. Durch ein Gen-Knockin können Gene gezielt eingefügt oder durch gezielte Insertionen inaktiviert und anschließend durch eine Entfernung der Insertion mittels einer Rekombinase wieder aktiviert werden. Durch das Gen-Knockin können durch ein Einfügen in Promotoren auch Gene inaktiviert werden, was zur Untersuchung der Funktionen unbekannter Gene oder als Modell für Gendefekt-basierte Krankheiten verwendet wird.<ref>A. Doyle, M. P. McGarry, N. A. Lee, J. J. Lee: The construction of transgenic and gene knockout/knockin mouse models of human disease. In: Transgenic research. Band 21, Nummer 2, April 2012, S. 327–349, ISSN 1573-9368. doi:10.1007/s11248-011-9537-3. PMID 21800101. PMC 3516403 (freier Volltext).</ref>

Limitationen

Das Einsetzen von Transgenen oder anderen Sequenzen hat mehrere limitationen. Einer der häufigsten Limitationen ist die unspezifische Aktivität. Die gRNA bindet dabei an einer anderen Stelle in dem Genom als geplant und das Cas-Protein schneidet dadurch nicht an der eigentlichen Zielsequenz, sondern an der ähnlichen stelle, wodurch die Spender-DNA an der falschen Stelle eingefügt wird.<ref>Neha Rohatgi, Jean-Philippe Fortin, Ted Lau, Yi Ying, Yue Zhang, Bettina L. Lee, Michael R. Costa, Rohit Reja: Seed sequences mediate off-target activity in the CRISPR-interference system. In: Cell Genomics. Band 4, Nr. 11, November 2024, S. 100693, doi:10.1016/j.xgen.2024.100693, PMID 39510079, PMC 11605690 (freier Volltext) – (elsevier.com [abgerufen am 16. September 2026]). </ref>

Einzelnachweise

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