Plasma-Sequenzierung

Die Plasma-Sequenzierung (auch Plasma-Seq) bezeichnet Methoden zur Sequenzierung des Genoms aus dem Plasma einer Blutprobe.<ref name="ref1">N. Navin, J. Kendall, J. Troge, P. Andrews, L. Rodgers, J. McIndoo, K. Cook, A. Stepansky, D. Levy, D. Esposito, L. Muthuswamy, A. Krasnitz, W. R. McCombie, J. Hicks, und M. Wigler: Tumour evolution inferred by single-cell sequencing. Nature, Band 472, Nr. 7341, Seiten 90–4, Apr. 2011.</ref><ref name="ref2">E. Heitzer, P. Ulz, J. Belic, S. Gutschi, F. Quehenberger, K. Fischereder, T. Benezeder, M. Auer, C. Pischler, S. Mannweiler, M. Pichler, F. Eisner, M. Haeusler, S. Riethdorf, K. Pantel, H. Samonigg, G. Hoefler, H. Augustin, J. B. Geigl, und M. R. Speicher: Tumor-associated copy number changes in the circulation of patients with prostate cancer identified through whole-genome sequencing. Genome Med., Band 5, Nr. 4, p. 30, Jan. 2013.</ref>

Prinzip[Bearbeiten]

Die Plasma-Seq wird zur Bestimmung von zirkulierender freier DNA, meistens im Rahmen der Diagnostik von Tumoren, eingesetzt. Dabei kommen sogenannte next-generation-Methoden der DNA-Sequenzierung zum Einsatz.<ref name="ref2" /><ref name="ref3">K. C. A. Chan, P. Jiang, Y. W. L. Zheng, G. J. W. Liao, H. Sun, J. Wong, S. S. N. Siu, W. C. Chan, S. L. Chan, A. T. C. Chan, P. B. S. Lai, R. W. K. Chiu und Y. M. D. Lo: Cancer genome scanning in plasma: detection of tumor-associated copy number aberrations, single-nucleotide variants und tumoral heterogeneity by massively parallel sequencing. Clin. Chem., Band 59, Nr. 1, Seiten 211–24, Jan. 2013.</ref><ref name="ref4">R. J. Leary, M. Sausen, I. Kinde, N. Papadopoulos, J. D. Carpten, D. Craig, J. O’Shaughnessy, K. W. Kinzler, G. Parmigiani, B. Vogelstein, L. A. Diaz und V. E. Velculescu: Detection of chromosomal alterations in the circulation of cancer patients with whole-genome sequencing. Sci. Transl. Med., Band 4, Nr. 162, p. 162ra154, Nov. 2012.</ref><ref name="ref5">M. Murtaza, S.-J. Dawson, D. W. Y. Tsui, D. Gale, T. Forshew, A. M. Piskorz, C. Parkinson, S.-F. Chin, Z. Kingsbury, A. S. C. Wong, F. Marass, S. Humphray, J. Hadfield, D. Bentley, T. M. Chin, J. D. Brenton, C. Caldas und N. Rosenfeld: Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA. Nature, Band 497, Nr. 7447, Seiten 108–12, Mai 2013.</ref> Dabei handelt es sich um eine nichtinvasive Methode zur Beurteilung der klonalen Evolution des Tumorgenoms.<ref name="ref2" /><ref name="ref3" /><ref name="ref6">S. Mohan, E. Heitzer, P. Ulz, I. Lafer, S. Lax, M. Auer, M. Pichler, A. Gerger, F. Eisner, G. Hoefler, T. Bauernhofer, J. B. Geigl und M. R. Speicher: Changes in colorectal carcinoma genomes under anti-EGFR therapy identified by whole-genome plasma DNA sequencing. PLoS Genet., Band 10, Nr. 3, Seite e1004271, Mar. 2014.</ref><ref name="ref9">E. Heitzer, M. Auer, P. Ulz, J. B. Geigl und M. R. Speicher: Circulating tumor cells and DNA as liquid biopsies. Genome Med., Band 5, Nr. 8, p. 73, Jan. 2013.</ref> Durch die Plasma-Sequenzierung können fehlerhafte Therapieentscheidungen gemindert und die Behandlung von Tumoren optimiert werden, sodass eine maximale Wirksamkeit mit geringeren Nebenwirkungen erzielt werden kann.<ref name="ref2" /><ref name="ref3" /><ref name="ref6" /> Plasma-Sequenzierung findet in der personalisierten Medizin ihren Einsatz, da sie die Überwachung des Tumorgenoms durch regelmäßige Blutabnahmen ermöglicht.<ref name="ref2" /><ref name="ref3" /><ref name="ref6" /><ref name="ref9" />

Problemstellung und Anwendung[Bearbeiten]

Für die Behandlung von Tumoren, wie zum Beispiel colorektalen Karzinomen und Prostatakarzinomen, ist es im Vorfeld wichtig, Genommutationen des Tumors herauszufinden, da diese die Therapien stark beeinflussen können. Bei colorektalen Entartungen mit einer KRAS-Mutation wirkt zum Beispiel keine Therapie mit monoklonalen Antikörpern, welche auf den Rezeptor des epidermalen Wachstumsfaktors (EGFR) gerichtet sind.<ref name="ref10">C. S. Karapetis, S. Khambata-Ford, D. J. Jonker, C. J. O’Callaghan, D. Tu, N. C. Tebbutt, R. J. Simes, H. Chalchal, J. D. Shapiro, S. Robitaille, T. J. Price, L. Shepherd, H.-J. Au, C. Langer, M. J. Moore und J. R. Zalcberg: K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer. N. Engl. J. Med., Band 359, Nr. 17, Seiten 1757–65, Oct. 2008.</ref><ref name="ref11">E. Van Cutsem, C.-H. Köhne, E. Hitre, J. Zaluski, C.-R. Chang Chien, A. Makhson, G. D’Haens, T. Pintér, R. Lim, G. Bodoky, J. K. Roh, G. Folprecht, P. Ruff, C. Stroh, S. Tejpar, M. Schlichting, J. Nippgen und P. Rougier: Cetuximab and chemotherapy as initial treatment for metastatic colorectal cancer. N. Engl. J. Med., Band 360, Nr. 14, Seiten 1408–17, Apr. 2009.</ref> Die Therapien richten sich dabei nach der Ausgangsdiagnose.<ref name="ref2" /><ref name="ref3" /> Es zeigt sich jedoch, dass die Tumore aus noch unerklärlichen Gründen nach einigen Monaten der Behandlung Resistenzen entwickeln können.<ref name="ref12">D. Cunningham, Y. Humblet, S. Siena, D. Khayat, H. Bleiberg, A. Santoro, D. Bets, M. Mueser, A. Harstrick, C. Verslype, I. Chau und E. Van Cutsem: Cetuximab monotherapy and cetuximab plus irinotecan in irinotecan-refractory metastatic colorectal cancer. N. Engl. J. Med., Band 351, Nr. 4, Seiten 337–45, Jul. 2004.</ref><ref name="ref13">E. Van Cutsem, M. Peeters; S. Siena, Y. Humblet; A. Hendlisz; B. Neyns; J.-L. Canon; J.-L. Van Laethem; J. Maurel; G. Richardson; M. Wolf und R. G. Amado: Open-label phase III trial of panitumumab plus best supportive care compared with best supportive care alone in patients with chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer. J. Clin. Oncol., Band 25, Nr. 13, Seiten 1658–64, Mai 2007.</ref> Da eine Tumorbiopsie eine sehr invasive Methode ist<ref name="ref9" />, besteht die Möglichkeit, die zellfreie DNA (cfDNA, cell-free DNA) im Plasma von Krebspatienten zu analysieren.<ref name="ref2" /><ref name="ref3" /><ref name="ref4" /><ref name="ref5" /><ref name="ref14">F. Diehl, M. Li, D. Dressman, Y. He, D. Shen, S. Szabo, L. A. Diaz, S. N. Goodman, K. A. David, H. Juhl, K. W. Kinzler und B. Vogelstein: Detection and quantification of mutations in the plasma of patients with colorectal tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., Band 102, Nr. 45, Seiten 16368–73, Nov. 2005.</ref><ref name="ref15">F. Diehl, K. Schmidt, M. A. Choti, K. Romans, S. Goodman, M. Li, K. Thornton, N. Agrawal, L. Sokoll, S. A. Szabo, K. W. Kinzler, B. Vogelstein und L. A. Diaz: Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics. Nat. Med., Band 14, Nr. 9, Seiten 985–90, Sep. 2008.</ref><ref name="ref16">T. Forshew; M. Murtaza; C. Parkinson; D. Gale; D. W. Y. Tsui; F. Kaper; S.-J. Dawson; A. M. Piskorz; M. Jimenez-Linan; D. Bentley; J. Hadfield; A. P. May; C. Caldas; J. D. Brenton und N. Rosenfeld: Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by targeted deep sequencing of plasma DNA. Sci. Transl. Med., Band 4, Nr. 136, Seite 136ra68, Mai 2012.</ref><ref name="ref17">E. Heitzer, M. Auer, E. M. Hoffmann, M. Pichler, C. Gasch, P. Ulz, S. Lax, J. Waldispuehl-Geigl, O. Mauermann, S. Mohan, G. Pristauz, C. Lackner, G. Höfler, F. Eisner, E. Petru, H. Sill, H. Samonigg, K. Pantel, S. Riethdorf, T. Bauernhofer, J. B. Geigl und M. R. Speicher: Establishment of tumor-specific copy number alterations from plasma DNA of patients with cancer. Int. J. Cancer, Band 133, Nr. 2, Seiten 346–56, Jul. 2013.</ref><ref name="ref18">R. J. Leary, I. Kinde, F. Diehl, K. Schmidt, C. Clouser, C. Duncan, A. Antipova, C. Lee, K. McKernan, F. M. De La Vega, K. W. Kinzler, B. Vogelstein, L. A. Diaz und V. E. Velculescu: Development of personalized tumor biomarkers using massively parallel sequencing. Sci. Transl. Med., Band 2, Nr. 20, p. 20ra14, Feb. 2010.</ref><ref name="ref19">D. J. McBride, A. K. Orpana, C. Sotiriou, H. Joensuu, P. J. Stephens, L. J. Mudie, E. Hämäläinen, L. A. Stebbings, L. C. Andersson, A. M. Flanagan, V. Durbecq, M. Ignatiadis, O. Kallioniemi, C. A. Heckman, K. Alitalo, H. Edgren, P. A. Futreal, M. R. Stratton und P. J. Campbell: Use of cancer-specific genomic rearrangements to quantify disease burden in plasma from patients with solid tumors. Genes. Chromosomes Cancer, Band. 49, Nr. 11, Seiten 1062–9, Nov. 2010.</ref><ref name="ref20">H. Schwarzenbach, D. S. B. Hoon und K. Pantel: Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients. Nat. Rev. Cancer, Band 11, Nr. 6, Seiten 426–37, Juni 2011.</ref> Krebszellen können ihre Tumor-DNA in den Blutkreislauf freisetzen, diese DNA nennt man ctDNA (circulating tumor DNA). Sie ist ein Teil der cfDNA.<ref name="ref9" /><ref name="ref21">E. Crowley, F. Di Nicolantonio, F. Loupakis und A. Bardelli: Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nat. Rev. Clin. Oncol., Band 10, Nr. 8, Seiten 472–84, Aug. 2013.</ref> Mit Hilfe einer Sequenzierung dieser DNA können genetische Mutationen identifiziert werden.<ref name="ref9" /><ref name="ref21" />

Diagnostik[Bearbeiten]

Einerseits wird die Methode der Plasma-Sequenzierung verwendet, um therapierelevante Mutationen aufzudecken (dies wird im Plasma jedoch nur dann durchgeführt, wenn kein relevantes Tumorgewebe zur Verfügung steht), andererseits ist die ctDNA nützlich, um tumor-spezifische Mutationen im Blut als Biomarker für Verlaufsbeobachtungen sowie Tumorrezidive frühzeitig zu erkennen.<ref name="ref2" /><ref name="ref6" /><ref name="ref9" /><ref name="ref14" /><ref name="ref15" /><ref name="ref16" /><ref name="ref18" /><ref name="ref19" /><ref name="ref22">L. A. Diaz, R. T. Williams, J. Wu, I. Kinde, J. R. Hecht, J. Berlin, B. Allen, I. Bozic, J. G. Reiter, M. A. Nowak, K. W. Kinzler, K. S. Oliner und B. Vogelstein The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature, Band 486, Nr. 7404, Seiten 537–40, Juni 2012.</ref><ref name="ref23">S. Misale, R. Yaeger, S. Hobor, E. Scala, M. Janakiraman, D. Liska, E. Valtorta, R. Schiavo, M. Buscarino, G. Siravegna, K. Bencardino, A. Cercek, C.-T. Chen, S. Veronese, C. Zanon, A. Sartore-Bianchi, M. Gambacorta, M. Gallicchio, E. Vakiani, V. Boscaro, E. Medico, M. Weiser, S. Siena, F. Di Nicolantonio, D. Solit und A. Bardelli: Emergence of KRAS mutations and acquired resistance to anti-EGFR therapy in colorectal cancer. Nature, Band 486, Nr. 7404, Seiten 532–6, Juni 2012.</ref> Die Plasma-Sequenzierung ermöglicht somit die Identifizierung von neuen Mutationen (z. B.: KRAS, MET oder ERBB2) eines Tumors bzw. kann bei der Diagnosefindung eine Hilfestellung sein. Dadurch kann für die betroffenen Patienten eine personen- und zielgerichtete Therapie ermöglicht werden.<ref name="ref6" /><ref name="ref24">W. De Roock, B. Claes, D. Bernasconi, J. De Schutter, B. Biesmans, G. Fountzilas, K. T. Kalogeras, V. Kotoula, D. Papamichael, P. Laurent-Puig, F. Penault-Llorca, P. Rougier, B. Vincenzi, D. Santini, G. Tonini, F. Cappuzzo, M. Frattini, F. Molinari, P. Saletti, S. De Dosso, M. Martini, A. Bardelli, S. Siena, A. Sartore-Bianchi, J. Tabernero, T. Macarulla, F. Di Fiore, A. O. Gangloff, F. Ciardiello, P. Pfeiffer, C. Qvortrup, T. P. Hansen, E. Van Cutsem, H. Piessevaux, D. Lambrechts, M. Delorenzi und S. Tejpar: Effects of KRAS, BRAF, NRAS, and PIK3CA mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer: a retrospective consortium analysis. Lancet. Oncol., Band 11, Nr. 8, Seiten 753–62, Aug. 2010.</ref> Durch die Instabilität des Tumorgenoms kann sich der Status von Biomarkern, die für die Einstellung einer Therapie wichtig sind, ändern.<ref name="ref2" /><ref name="ref3" /><ref name="ref6" /> Durch frühes Reagieren auf neue Mutationen des Tumors kann man Therapien umstellen und dadurch ein Fortschreiten der Krankheit verhindern oder verzögern.<ref name="ref6" />

Ein Nachteil der Plasma-Sequenzierung ist, dass keine zielgerichtete Aussage über die Entstehung des Tumors getroffen werden kann. Eine Differenzierung des Entstehungsortes (des primären Tumorgewebes oder der Metastasen) ist bis dato nicht möglich. Dies liegt daran, dass die ctDNA sowohl vom einen wie auch dem anderen Tumor abstammen kann.<ref name="ref2" />

Durchführung[Bearbeiten]

Bei der Plasma-Sequenzierung handelt es sich um eine next-generation-Sequenzierung. Zu Beginn wird die DNA in der Plasmaprobe aufgereinigt und isoliert. Anschließend werden die Proben für eine Sequenzierung mit Brückensynthese vorbereitet. Dabei wird die Template-DNA fragmentiert und Adaptersequenzen werden an die DNA-Fragmente angefügt, sodass sie an einen Glasobjektträger gebunden sind. Auf diesem Objektträger findet die Sequenzierung statt und durch einen PCR-ähnlichen Schritt werden zyklusweise Cluster aus identischen Molekülen gebildet. Je Zyklus wird genau ein fluoreszenzmarkiertes Nukleotid komplementär zur Template-DNA eingebaut. Das Lichtsignal des Fluorophors kann detektiert und verarbeitet werden und im nächsten Zyklus erfolgt der nächste Einbau eines Nukleotids.<ref name="ref2" /><ref name="ref6" /><ref name="ref17" />

Für eine Analyse benötigt man ein Gerät für eine Sequenzierung, im Speziellen für eine Sequenzierung durch Synthese. Es besteht auch die Möglichkeit einer paired-end-Sequenzierung, welche die Genauigkeit der Analyse erhöhen kann. In diesem Fall werden die DNA-Fragmente von beiden Seiten sequenziert.<ref name="ref2" /><ref name="ref6" /><ref name="ref17" />

Mit einem Instrument für eine Gesamtgenomsequenzierung mit einem hohen Durchsatz und einer Sequenzierungstiefe von 0,1–0,2x aus einer Plasmaprobe kann man bereits innerhalb von zwei Tagen mit geringen Kosten ein genomweites Tumorprofil inklusive Kopiezahlvariationen erstellen.<ref name="ref2" /><ref name="ref3" /><ref name="ref5" /><ref name="ref6" /><ref name="ref25">N. J. Loman, R. V Misra, T. J. Dallman, C. Constantinidou, S. E. Gharbia, J. Wain, und M. J. Pallen: Performance comparison of benchtop high-throughput sequencing platforms. Nat. Biotechnol., Band 30, Nr. 5, Seiten 434–9, Mai 2012.</ref>

Methodenvergleich[Bearbeiten]

Es besteht auch die Möglichkeit, das Tumorgenom durch zirkulierende Tumorzellen (CTC) zu überprüfen. Zirkulierende Tumorzellen werden von primären und metastasierenden Tumoren in die Blutbahn abgegeben und können dann isoliert und charakterisiert werden.<ref name="ref9" /><ref name="ref26">C. Alix-Panabières und K. Pantel: Circulating tumor cells: liquid biopsy of cancer. Clin. Chem., Band 59, Nr. 1, Seiten 110–8, Jan. 2013.</ref><ref name="ref27">S. Maheswaran und D. A. Haber: Circulating tumor cells: a window into cancer biology und metastasis. Curr. Opin. Genet. Dev., Band 20, Nr. 1, Seiten 96–9, Feb. 2010.</ref><ref name="ref28">M. Yu, S. Stott, M. Toner, S. Maheswaran, und D. A. Haber: Circulating tumor cells: approaches to isolation und characterization. J. Cell Biol., Band 192, Nr. 3, Seiten 373–82, Feb. 2011.</ref> Die Genotypen der CTCs ermöglichen Abschätzungen von Medikamentensensitivität sowie Resistenzen und können bei der Entscheidung der Therapie behilflich sein.<ref name="ref9" /> Zusätzlich können CTCs Aufschluss über die Prognose geben.<ref name="ref9" /><ref name="ref29">M. Cristofanilli, G. T. Budd, M. J. Ellis, A. Stopeck, J. Matera, M. C. Miller, J. M. Reuben, G. V Doyle, W. J. Allard, L. W. M. M. Terstappen, und D. F. Hayes: Circulating tumor cells, disease progression, und survival in metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med., Band 351, Nr. 8, Seiten 781–91, Aug. 2004.</ref><ref name="ref30">M. Cristofanilli, D. F. Hayes, G. T. Budd, M. J. Ellis, A. Stopeck, J. M. Reuben, G. V Doyle, J. Matera, W. J. Allard, M. C. Miller, H. A. Fritsche, G. N. Hortobagyi, und L. W. M. M. Terstappen: Circulating tumor cells: a novel prognostic factor for newly diagnosed metastatic breast cancer., J. Clin. Oncol., Band 23, Nr. 7, Seiten 1420–30, März 2005.</ref><ref name="ref31">W. J. Allard, J. Matera, M. C. Miller, M. Repollet, M. C. Connelly, C. Rao, A. G. J. Tibbe, J. W. Uhr und L. W. M. M. Terstappen: Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases. Clin. Cancer Res., Band 10, Nr. 20, Seiten 6897–904, Okt. 2004.</ref><ref name="ref32">D. C. Danila, M. Fleisher, und H. I. Scher: Circulating tumor cells as biomarkers in prostate cancer. Clin. Cancer Res., Band 17, Nr. 12, Seiten 3903–12, Juni 2011.</ref><ref name="ref33">J. S. de Bono, H. I. Scher, R. B. Montgomery, C. Parker, M. C. Miller, H. Tissing, G. V Doyle, L. W. W. M. Terstappen, K. J. Pienta, und D. Raghavan: Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin. Cancer Res., Band 14, Nr. 19, Seiten 6302–9, Okt. 2008.</ref>

	CTC-Analyse	ctDNA-Analyse
Ausstattung	spezielle Geräte zur Identifizierung und von CTCs	einfache Blutprobe
Isolierung	komplexe Isolierung von CTCs	keine spezielle Isolierung, sondern eine Standard-DNA-Aufreinigung
Informationen über Heterogenität und Klonalität	Ja, wenn ausreichend Zellen analysiert sind	Nein, die Ergebnisse spiegeln den Durchschnitt der ctDNA von allen Tumorzellen wider

Literatur[Bearbeiten]

Evelyn Kidess, Stefanie S. Jeffrey: Circulating tumor cells versus tumor-derived cell-free DNA: rivals or partners in cancer care in the era of single-cell analysis? In: Genome Medicine. Band 5, Nr. 8, 13. August 2013, S. 70, doi:10.1186/gm474, PMID 23953663.
Martina Auer, Ellen Heitzer, Peter Ulz, Jochen B Geigl, Michael R Speicher: Single circulating tumor cell sequencing for monitoring. In: Oncotarget. Band 4, Nr. 6, 10. Mai 2013, S. 812–813, PMID 23868872.
M. Zapatka, P. Lichter: Moderne Techniken der Gendiagnostik. In: Der Gynäkologe. Band 45, Nr. 1, 12. Januar 2012, S. 11–16, doi:10.1007/s00129-011-2856-x.

Weblinks[Bearbeiten]

Tumor DNA Analytik im Plasma. In: indivutest.com. 17. Oktober 2012, abgerufen am 20. Juli 2015.

Verweise[Bearbeiten]