BCA-Test
Der BCA-Test ist eine biochemische Methode, um Proteine unter Verwendung von Bicinchoninsäure (BCA) quantitativ zu bestimmen.
Prinzip[Bearbeiten]
An die Peptidbindung binden zweiwertige Kupferionen und werden bei alkalischem pH-Wert zu einwertigen Kupferionen reduziert. In Anwesenheit von BCA bilden die Kupferionen mit BCA einen blau-violetten Farbstoffkomplex. Bicinchoninsäure ist im alkalischen pH-Wert stabil, wodurch im Gegensatz zum Lowry-Test ein Arbeitsschritt weniger notwendig ist.<ref name="Walker">John M. Walker: The Protein Protocols Handbook. Springer Science & Business Media, 2008, ISBN 978-1-603-27259-9, S. 11.</ref> Die Nachweisgrenze ist vergleichbar mit dem Lowry-Test.<ref name="Walker"/> Weiterhin ist der BCA-Test weniger störanfällig gegenüber den Chaotropen Harnstoff und Guanidiniumchlorid, gegenüber den Salzen Ammoniumsulfat und Cäsiumhydrogencarbonat und gegenüber den Tensiden Triton X-100, SDS, Brij 35, Lubrol, CHAPS, CHAPSO und Octylglucosid.<ref name="Walker"/>
Die Reagenzlösung besteht aus den Stammlösungen A (10 g/L Natriumbicinchoninat, 20 g/L Natriumcarbonat, 1,6 g/L Natriumtartrat, 4 g/L Natriumhydroxid, 9,5 g/L Natriumhydrogencarbonat, auf einen pH-Wert von 11,25 mit Natriumhydroxid eingestellt) und B (40 g/L Kupfersulfat-Pentahydrat) in einem Mischungsverhältnis von 50 zu 1.<ref name="Pingoud">Alfred Pingoud: Arbeitsmethoden der Biochemie. Walter de Gruyter, 1997, ISBN 978-3-110-16513-5, S. 152.</ref> Die grünliche Reagenzlösung wird vor Gebrauch frisch aus den Stammlösungen angesetzt.<ref name="Pingoud"/> Die Probe wird 1:50 mit der Reagenzlösung verdünnt und 30 Minuten bei 60 °C erhitzt.<ref name="Pingoud"/> Der entstandene lila Farbstoff wird durch Photometrie bei einer Wellenlänge von 562 nm quantifiziert.<ref name="Pingoud"/> Während bei Raumtemperatur vor allem die Aminosäuren Cystein, Cystin, Tryptophan und Tyrosin zweiwertige Kupferionen reduzieren, werden die Kupferionen bei 60 °C auch durch die Peptidbindung reduziert, wodurch das Messergebnis weniger von der Aminosäurezusammensetzung der jeweils gemessenen Proteine abhängt.<ref name="Olsen"/>
Geschichte[Bearbeiten]
Der BCA-Test wurde 1985 von P. K. Smith und Kollegen veröffentlicht.<ref>P. K. Smith, R. I. Krohn, G. T. Hermanson, A. K. Mallia, F. H. Gartner, M. D. Provenzano, E. K. Fujimoto, N. M. Goeke, B. J. Olson, D. C. Klenk: Measurement of protein using bicinchoninic acid. In: Analytical biochemistry. Band 150, Nummer 1, Oktober 1985, S. 76–85, PMID 3843705. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7.</ref> Er basiert auf dem Lowry-Test von 1951,<ref name="Lowry">Oliver H. Lowry et al.: Protein measurement with the Folin phenol reagent. In: J. Biol. Chem. Band 193, Nr. 1, 1951, S. 265–275. PMID 14907713. Die Seite Vorlage:Webarchiv/styles.css hat keinen Inhalt.PDF ( vom 29. September 2007 im Internet Archive).</ref> der wiederum auf die Biuret-Reaktion zur Proteinbestimmung von 1949<ref>A. G. Gornall, S. J. Bardawill, M. M. David: Determination of serum proteins by means of the biuret reaction. In: J Biol Chem. Band 177(2), 1949, S. 751–766. PMID 18110453.</ref> und das Folin-Ciocalteu-Reagenz von 1927 zurückgreift.<ref>Vorlage:Cite book/URLVorlage:Cite book/MeldungVorlage:Cite book/MeldungVorlage:Cite book/MeldungVorlage:Cite book/MeldungVorlage:Cite book/MeldungVorlage:Cite book/MeldungVorlage:Cite book/Meldung2</ref> BCA ersetzt beim BCA-Test das Folin-Ciocalteu-Reagenz im Lowry-Test.<ref name="Olsen">Vorlage:Cite book/URLVorlage:Cite book/MeldungVorlage:Cite book/MeldungVorlage:Cite book/MeldungVorlage:Cite book/MeldungVorlage:Cite book/MeldungVorlage:Cite book/MeldungVorlage:Cite book/Meldung2</ref>
Literatur[Bearbeiten]
- C. M. Stoscheck: Quantitation of protein. In: Methods in enzymology. Band 182, 1990, S. 50–68, PMID 2314256.
Einzelnachweise[Bearbeiten]
<references />